膀胱脱细胞胶原基质复合血管内皮生长因子修复兔尿道缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0683

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (34): 5477-5483.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0683

• 细胞外基质材料 extracellular matrix materials • 上一篇下一篇

膀胱脱细胞胶原基质复合血管内皮生长因子修复兔尿道缺损

顾绍栋¹，周云²，熊前卫²，张亚³，杨金龙⁴

¹连云港市第一人民医院儿外科，江苏省连云港市 222002；苏州大学附属儿童医院， ²小儿泌尿外科，³实验室，江苏省苏州市 215025；⁴无锡市第八人民医院小儿外科，江苏省无锡市 214000

收稿日期:2018-07-10 出版日期:2018-12-08 发布日期:2018-12-08
通讯作者: 周云，博士生导师，苏州大学附属儿童医院小儿泌尿外科，江苏省苏州市 215025
作者简介:顾绍栋，男，1980年生，江苏省赣榆县人，汉族，硕士，副主任医师，主要从事小儿泌尿外科学研究。
基金资助:
江苏省临床医学科技专项-新型临床诊断技术攻关项目(BL2012051)

Bladder acellular matrix combined with vascular endothelial growth factor repairs rabbit urethral defects

Gu Shaodong¹, Zhou Yun², Xiong Qianwei², Zhang Ya³, Yang Jinlong⁴

¹Department of Pediatric Surgery, Lianyungang No. 1 Hospital, Lianyungang 222002, Jiangsu Province, China; ²Department of Pediatric Urology, ³Laboratory, Children Hospital of Soochow University, Suzhou 215025, Jiangsu Province, China; ⁴Department of Pediatric Surgery, Wuxi No. 8 People’s Hospital, Wuxi 214000, Jiangsu Province, China

Received:2018-07-10 Online:2018-12-08 Published:2018-12-08
Contact: Zhou Yun, Doctoral supervisor, Department of Pediatric Urology, Children Hospital of Soochow University, Suzhou 215025, Jiangsu Province, China
About author:Gu Shaodong, Master, Associate chief physician, Department of Pediatric Surgery, Lianyungang No. 1 Hospital, Lianyungang 222002, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Jiangsu Provincial Clinical Medical Science and Technology Special Project - New Clinical Diagnostic Technology Research Project, No. BL2012051

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

膀胱无细胞基质：是通过一系列物理化学技术处理后，去除异体膀胱中的细胞成分得到的脱细胞基质材料，这种材料保持了原有的组织三维结构，组织工程中以此移植物作为支架材料，为宿主细胞的长入、组织重建提供必要的临时性支架，该支架会在新生组织形成过程中逐渐降解达到组织重建的目的。

血管内皮生长因子：是由Ferrara等最早于1989年从牛脑垂体滤泡星状细胞体外培养液中分离、纯化出来的一种糖蛋白，它能促进血管内皮细胞有丝分裂，加速新生血管的形成，是已发现的众多血管生成正调节因子当中促血管生成效应最强的因子。

背景：采用膀胱无细胞基质作为游离移植物修复尿道缺损，诱导尿道再生取得一定的成果，但该方法仍未能从根本上解决移植物血管再生不足的问题。

目的：观察复合血管内皮生长因子的异种膀胱脱细胞基质修复兔尿道缺损的效果。

方法：将30只成年新西兰大白兔随机分为5组，每组6只，模型组、对照组、实验组均制作尿道缺损模型，随后对照组、实验组分别采用猪膀胱脱细胞基质、复合血管内皮生长因子的猪膀胱脱细胞基质进行修复，同时设立正常组、假手术组。术后4，12周分批处死动物，进行尿道造影、尿流率及免疫组织化学检测。

结果与结论：①实验组术后4，12周的平均尿流率高于模型组、对照组(P < 0.05)，与正常组、假手术组比较无差异；②术后12周尿道造影显示，实验组尿路线条流畅；模型组、对照组尿路线条欠流畅；③苏木精-伊红染色显示，模型组胶原纤维细胞较多，纤维排列紊乱，有较多淋巴细胞浸润；实验组胶原基质基本降解，新生胶原纤维排列规律，其间血管较多，未见血管瘤等；对照组见团块状胶原沉积，视野内血管较少；④术后12周Masson染色显示，实验组胶原组织沉积明显少于对照组、模型组(P < 0.05)，接近正常组和假手术组(P > 0.05)；⑤术后12周CD31染色显示，实验组新生血管数量明显多于对照组、模型组(P > 0.05)，接近正常组和假手术组(P > 0.05)；⑥术后12周a-SMA免疫组织化学染色显示，实验组再生肌肉含量明显高于对照组和模型组(P < 0.05)，接近正常组和假手术组(P > 0.05)；⑦结果表明，复合血管内皮生长因子的异种膀胱脱细胞基质修复兔尿道缺损，可促进移植物局部血管新生，提高再生尿道肌肉含量，加速局部胶原降解，改善尿道再生微环境，促进尿道更好地再生。ORCID: 0000-0001-7624-1255(顾绍栋)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 膀胱脱细胞基质, 血管内皮生长因子, 组织工程, 尿道缺损, 兔, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: The use of bladder acellular matrix as a free graft to repair urethral defects and induce urinary tract regeneration has achieved certain results, but this method cannot fundamentally solve insufficient angiogenesis of the graft.

OBJECTIVE: To observe the effect of bladder acellular matrix (BAM) combined with vascular endothelial growth factor (VEGF) in the repair of rabbit urethral defects.

METHODS: Thirty adult New Zealand rabbits were randomly allocated into five groups (n=6 per group), including healthy control group, sham operation group, model group, BAM group, and BAM combined with VEGF group (VEGF-BAM group). Animal models of urethral defect were made in the latter three groups. The animals were sacri?ced at 4 and 12 weeks after surgery, respectively. The penis was immediately harvested for standardized passive ?owmetry, urethral radiography and subsequently ?xed for immunohistochemical staining for evaluation.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The average urinary flow rate of the VEGF+BAM group was significantly higher than that of the model group and BAM group at 4 and 12 weeks after surgery (P < 0.05), while there was no difference from the healthy control group and sham operation group. (2) Urethral radiography at 12 weeks after surgery indicated that urethra continuity was repaired with no urethral fistula in the VEGF+BAM group, but not incompletely in the model and BAM groups. (3) Hematoxylin-eosin staining results indicated there were more collagen fibers and infiltrated lymphocytes in the model group, with the fiber arrangement being disordered; the collagen matrix in the VEGF+BAM group was basically degraded, new collagen fibers arranged regularly, and there were many blood vessels, but no hemangioma; and in the BAM group, massive collagen deposition and less blood vessels were observed. (4) Masson staining results indicated that less collagen deposition was observed in VEGF+BAM group compared with BAM group and model group at 12 weeks after surgery (P < 0.05), which was similar to the healthy control group and sham operation group (P > 0.05). (5) CD31 staining results indicated that the local density of new blood vessels in the VEGF+BAM group was significantly higher than that in the BAM and models groups at 12 weeks after surgery (P > 0.05), which was also close to the value in the healthy control and sham operation groups (P > 0.05). (6) Regeneration of urethral smooth muscle in the VEGF+BAM group was significantly better than that in the BAM and model groups at 12 weeks after surgery (P < 0.05), as indicated by a-SMA immunohistochemical staining. Moreover, there was no significant difference among VEGF+BAM group, sham operation group and health control group. To conclude, BAM scaffolds combined with VEGF show a totally potential capacity in inducing the urethral reconstruction. The combined use of VEGF and BAM can stimulate angiogenesis, decrease the rate of collagen deposition, promote urethral smooth muscle regeneration, and improve the urethra regeneration microenvironment in urethral reconstruction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Urinary Bladder, Vascular Endothelial Growth Factors, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

顾绍栋，周云，熊前卫，张亚，杨金龙. 膀胱脱细胞胶原基质复合血管内皮生长因子修复兔尿道缺损[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(34): 5477-5483.

Gu Shaodong, Zhou Yun, Xiong Qianwei, Zhang Ya, Yang Jinlong. Bladder acellular matrix combined with vascular endothelial growth factor repairs rabbit urethral defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(34): 5477-5483.

图/表（结果） 10

2.1 实验动物数量分析 30只兔均进入结果分析。

2.2 术后一般情况观察实验动物术后3 d拔除尿管，术后起初一二天有少量血性尿液，后尿液转为正常，未见发热、食欲不振、排尿困难等症状。

2.3 术后不同时间点各组尿流率测定结果术后4，12周，5组动物均完整解剖出了阴茎组织，完成了尿流率的测定，正常组和实验组尿流率数值较高，曲线平滑(图3A，B)；模型组和对照组曲线低平，稍粗糙(图3C，D)。各组平均尿流率测定结果见表1。

根据图表及统计学分析，可见实验组尿流动力学评估明显优于模型组与对照组(P < 0.05)；对照组与模型组尿流动力学评估无明显差异，实验组和假手术组、正常组之间尿流动力学评估差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 体外尿道造影检查术后12周，在测定完尿流率之后，用同样的装置行尿道造，可发现实验组尿道体外造影均显示尿道后壁平滑，尿路线条流畅；对照组和模型组略显示有的瘢痕生长的痕迹，尿路线条欠流畅(图4)。

2.5 术后不同时间点各组尿道标本苏木精-伊红染色观察模型组、对照组和实验组中均有尿路上皮层、平滑肌组织和血管的再生，新生尿道组织层次清，黏膜层、浆膜层、肌层排列规律，上皮细胞形态正常，无明显畸形。实验组较模型组、对照组上皮细胞排列更规律，局部血供更丰富，再生肌肉形态更成熟。

术后4周，模型组黏膜上皮厚度较周边薄；黏膜下有较多胶原纤维细胞生长，纤维排列紊乱，其间少量淋巴细胞浸润；对照组和实验组黏膜厚度基本正常，黏膜下胶原基质内有较多淋巴细胞浸润；实验组上皮修复良好，基质表面可见完整的黏膜覆盖，黏膜下层可见未完全降解的胶原基质，基质内有新的胶原纤维细胞生长，可见新生血管长入，对照组基质内未见明显新生血管。术后12周，模型组胶原纤维细胞进一步增多，纤维排列紊乱，有较多淋巴细胞浸润；实验组胶原基质基本降解，新生胶原纤维排列规律，其间血管较多，未见血管瘤等；对照组见团块状胶原沉积，视野内血管较少(图5)。

2.6 术后不同时间点各组尿道标本Masson染色胶原退化情况观察术后4周，模型组黏膜下见粗大的胶原纤维，纤维间可见少量血管新生；实验组修补的移植物部分胶原含量较高，其内有较多红细胞分布；对照组胶原纤维粗大，纤维间红细胞数量明显较实验组少。术后12周，模型组胶原纤维较前更粗大，纤维间血管量少，瘢痕倾向明显；对照组黏膜下胶原沉积明显，可见团块状胶原分布，其内有少量红细胞；实验组胶原沉积较少，视野内见密集血管分布(图6)。

用IPP 6.0软件统计进行统计学处理，结果如下：术后4周，模型组、对照组、实验组胶原含量均高于正常组和假手术组(P < 0.05)；术后12周，实验组胶原组织沉积明显少于对照组、模型组(P < 0.05)，接近正常组和假手术组(P > 0.05)，见表2。

2.7 术后不同时间点各组尿道标本CD31染色新生血管情况观察术后4周，模型组内纤维间少量血管分布，对照组胶原块周边可见少量血管分布，实验视野下见较多血管分布。术后12周，模型组纤维较4周时间更粗大，排列紧凑，纤维间见少量血管，分布不均匀；对照组胶原团块缩小，血管分布较均匀，数量较少；实验组血管数量较多，分布均匀(图7)。

由镜下观察发现，无论术后4周还是12周，不同组间新生血管的形态学均接近成熟，血管壁完整，血管通透性良好，无明显红细胞外溢，水肿等其他炎性表现。

经CD31染色剂染色后，用200倍视野下，每切片取3个以上视野对镜下的血管数目进行统计，观察统计各组尿道组织中血管数量，统计学分析可看出，同周期实验组明显优于对照组、模型组(P < 0.05)，见表3。

2.8 术后不同时间点各组尿道标本α-SMA免疫组织化学染色观察 α-SMA免疫组织化学染色后，肌肉呈淡黄色。术后4周，各组均存在未分化成熟的肌肉组织，表现为肌肉含量少，肌肉形态不规则，肌成纤维细胞假阳性率高等。术后12周，实验组诱导的再生肌肉分化成熟度明显高于对照组和模型组，表现为肌肉成规则状排列，形态结构完整，成条束状，肌肉组织层次清楚，考虑在VEGF诱导作用下，肌纤维细胞假阳性率降低，向肌肉细胞方向分化加强，肌肉含量较之前增多(图8)。

用IPP 6.0软件统计200倍放大视野内再生平滑肌所占面积百分比，可观察到，实验组再生肌肉含量明显高于对照组和模型组(P < 0.05)，见表4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机分组，对比观察动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年10月至2015年10月在连云港市第一人民医院完成。

1.3 材料

实验动物：选用健康雄性新西兰大白兔，体质量2.0-2.5 kg，由苏州大学实验动物中心提供，许可证号：201501200。所有实验动物均采购自苏州大学医学动物实验室，且所有操作、饲养、处死等动物处置方式均遵循实验动物实验室实施管理条例。

实验用主要试剂与仪器：VEGF(瑞典perpotech公司)；Masson特殊染色剂(珠海贝索生物技术有限公司)；Anti-CD31抗体(JC/70A，abcam贸易有限公司)；Anti-Actin抗体[ACTN05(C4)，abcam贸易有限公司]；MaxVisionTM2检测试剂(兔) (迈新生物技术开发有限公司)；尿流率测试仪器(UROCAPIII，laborie医疗技术公司)，多任务尿动力系统(11Rel 5 Build 10B，laborie医疗技术公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 脱细胞基质的制备取新鲜猪膀胱，PBS持续浸泡、震荡5 h，室温下充分洗涤；室温下，将猪膀胱置于含0.1%叠氮化钠的PBS充分震荡洗涤24 h；将猪膀胱置于含有0.5%Triton-×100的溶液里，震荡洗涤过夜；PBS漂洗膀胱30 min，后置于0.5%胰蛋白酶-EDTA(0.5 mmol/L)震荡消化24 h；PBS洗涤后转移至含DNA酶和RNA酶各 40 U/mL的1 mol/L氯化钠溶液中，室温下震荡消化36 h；PBS震荡漂洗30 min，置入Tris缓冲的1%SDS溶液中持续浸泡振荡洗涤24 h；PBS漂洗至洗涤液澄清；4%脱氧胆酸钠、0.1%的叠氮化钠溶液持续浸泡搅拌24 h；PBS反复漂洗至洗涤液澄清；冻干，备用。

1.4.2 动物体内的脱细胞基质替代实验将制备好的脱细胞基质修剪成4 mm×10 mm大小的形态，经过超纯水中水化24 h。将制备好的膀胱无细胞基质置入质量浓度为0.04 mg/L的VEGF溶液中，于37 ℃无菌环境中孵化24 h。

将30只成年雄性新西兰大白兔随机分为5组，假手术组、模型组、对照组、实验组及正常组，每组6只。正常组不作任何处理。耳缘静脉注射3%戊巴比妥纳溶液(25-35 mg/kg)+局部使用0.5%利多卡因麻醉假手术组、模型组、对照组、实验组兔，手术区域备皮、消毒，假手术组仅切开尿道前壁后做缝合处理，模型组、对照组、实验组沿阴茎腹侧中线逐层切开包皮、尿道海绵体，长约1.5 cm (图1A)，剪除尿道背侧尿道海绵体及黏膜约4 mm×10 mm，形成尿道缺损(图1B)。对照组与实验组分别用膀胱无细胞胶原基质材料(图1C)和复合VEGF的膀胱无细胞胶原基质材料修补于上述尿道缺损处(图1D)。术后肌肉注射抗生素 3 d以上，保留导尿管3 d。实验动物样本采集时间分别为术后4，12周。

1.5 主要观察指标

一般情况观察：观察兔术后存活情况，是否有血性尿液、持续时间等，术后动物体温、食欲、有无排尿困难、尿瘘等症状。

尿流率测定：术后4，12周，每组每个时间点处死3只兔，完整解剖出兔的阴茎及部分膀胱组织，采用Leslie等^[16]的离体测量方式测量尿流率(图2)并进行统计学分析。

组织病理学观察：①苏木精-伊红染色后，组织切片置于40倍视野观察标本大体形态，在200倍视野下，镜下观察再生组织的上皮细胞排列、胶原、血管及肌肉组织等形态学特征；②Masson染色后，对视野下胶原基质(即 Masson染色阳性区域)进行测定，通过阳性区域百分比表达对比实验组和对照组中胶原基质的降解情况；③α-SMA免疫组织化学染色，对视野下平滑肌含量(即α-SMA抗体阳性区域)进行测定，通过阳性区域百分比表达对比实验组和对照组的平滑肌再生情况；④组织新生血管CD31免疫组织化学染色，对再生组织中新生血管的数量进行分析评价。

1.6 统计学分析所有统计数据均以x(_)±s表示，数据的统计分析通过SPSS 16.0软件进行，对于实验组和对照组的统计学分析采用配对t 检验，P < 0.05时两组差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

临床上尿道缺损性疾病的治疗一直是泌尿外科的难题。尿道重建中常因为局部重建尿道材料的不足而需要采用口腔黏膜、小肠黏膜、膀胱黏膜、包皮等作为替代材料，术后引起的并发症屡见不鲜，并且取材部位造成了新创伤。因此寻找可靠的、易获得的尿道替代材料成为了研究者探索的方向，而组织工程医学的发展也为解决这一问题提供了新的思路^[10-15]。

组织工程是20世纪90年代兴起的医学新领域^[15]。膀胱脱细胞基质材料一直是泌尿系统组织工程研究领域中的热点，膀胱脱细胞基质是通过一系列物理化学技术处理后，去除异体膀胱中的细胞成分得到的脱细胞基质材料。这种材料保持了原有的组织三维结构，组织工程中以此移植物作为支架材料，为宿主细胞的长入、组织重建提供必要的临时性支架，该支架会在新生组织形成过程中逐渐降解达到组织重建的目的^[17-20]，膀胱脱细胞基质组织相容性好，来源广泛，制作成本相对低廉，有利于手术缝合，替代组织前无需再塑形等优点，在组织工程中得到了广泛的应用^[21]。

但是随着组织工程学的发展，单纯使用支架材料修补器官，辅助组织器官重建存在诸多的局限性，如瘢痕挛缩、移植物脱落、神经修复不彻底，导致重建后的组织生理功能缺陷等。在相关研究报道中，De Filippo等^[22]在2002年报道了用膀胱上皮细胞种植的胶原基质材料修复1 cm雄性兔尿道缺损；Shokeir等^[23]报道了应用脱细胞基质支架材料修复3 cm狗尿道缺损，两种实验结果均表明存在尿道狭窄等局限性。Atala等^[24]也报道了对尿道下裂儿童因传统手术治疗失败而采用膀胱脱细胞基质修复其尿道缺损共4例，术后随访3年过程中，有患儿再次出现尿瘘，也进一步印证了研究的不足之处。之后的组织工程研究中，移植复合物逐渐成为热点。移植复合物是指通过整合宿主细胞、移植物支架、细胞因子，使其具有最佳的移植状态对组织、器官进行修复重建。在De Filippo等的实验中已经对宿主细胞结合膀胱无细胞基质的重建效果进行了初步的探讨，但其实验结果表明仍不够理想，考虑与种子细胞与无细胞基质支架在培养液中存活良好，但对外部环境难以适应有关，相比之下细胞因子的使用在组织修复中的作用值得期待。2004年，Kanematsu等^[25-26]最先尝试了从血管再生角度来改善膀胱无细胞基质移植物的再生能力，他们将膀胱无细胞基质浸入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)溶液，利用碱性成纤维细胞生长因子进入体内后可刺激机体产生VEGF促进血管再生这一原理，诱导血管新生而促进组织再生、抑制移植物挛缩。2005年，Youssif等^[27]将膀胱脱细胞基质孵育于VEGF溶液里12 h，而后用复合VEGF的膀胱脱细胞基质进行膀胱替代，术后2-4周内观察到实验组替代的膀胱容量、逼尿肌压力及血管新生情况要明显优于移植物孵育于无菌平衡液的对照组。后续学者也对胶原基质复合VEGF蛋白修复组织做了大量研究，结果表明复合VEGF的基质明显有更强的血管再生和组织修复能力^[28-32]。

VEGF是由Ferrara等^[33]最早于1989年从牛脑垂体滤泡星状细胞体外培养液中分离、纯化出来的一种糖蛋白，它能促进血管内皮细胞有丝分裂，加速新生血管的形成。VEGF是已发现的众多血管生成正调节因子当中促血管生成效应最强的因子。过往组织工程研究也表明，胶原基质作为支架材料复合应用VEGF后植入体内后，VEGF能够促进基质内血管的再生，改善宿主细胞植入的微环境，增加血液供应，促进组织重建^[34]。在此次实验中，将膀胱脱细胞基质在VEGF蛋白溶液中孵化24 h，将经过复合VEGF的脱细胞基质植入体内，诱导尿道重建再生。术后4，12周处死动物后，对不同组别之间再生尿道的形态学、功能学、组织学特征进行评估对比、从实验结果来看，复合VEGF的无细胞基质移植物行替代手术后，再生尿道组织中同周期新生血管的数量明显高于单纯使用无细胞基质进行手术替代后的再生组织，表明VEGF进入体内后刺激移植物血管新生，提供良好的代谢与营养途径的同时，并且没有产生血管瘤等一系列血管性病变^[35-36]。在此基础上，作者提出大胆猜想，通过在局部释放生长因子，刺激血管生长，加速局部组织血供网络构建，可以抑制移植物的坏死、挛缩，将移植物用于修补尿道缺损，能够有效降低术后并发症的发生率，为修复尿道下裂提供新的思路。

通过IPP 6.0软件对组织内胶原含量进行定量分析，对再生尿道的肌肉再生情况进行评估，并通过对比统计发现，复合VEGF的膀胱脱细胞基质实验组胶原降解明显快于对照组，肌肉再生情况优于对照组。表明VEGF在促进血管化的同时，改善再生的微环境，有效促进了胶原降解这一过程。尿流率的检测结果也反映了实验组中修复后尿道功能优于模型组及对照组。

实验结果表明，复合VEGF的膀胱脱细胞基质在修复尿道缺损过程当中，VEGF可刺激局部微血管的生成，改善组织再生微环境，加速胶原吸收进度，促进尿道的组织再生。尿道功能及组织学特征评价均表明，脱细胞基质诱导尿道再生能力均有着明显提升，且未有局部及全身并发症情况发生，复合方法安全、有效。因此认为该方法为尿道缺损修复提供了新的提示，为下一步临床上如何更好地修复尿道缺损提供了新的思路。

此次研究也存在一些不足之处如：尿流率和尿道造影影像学图片数据支撑力度不够，下一步需要提供更多样本数据，可能的话做活体排尿造影或断层CT扫描或MRI扫描，并做深入的统计学分析；只研究了一种细胞因子复合的膀胱无细胞基质支架材料的组织修复效果，没有更多的复合诸如种子细胞、其他多种细胞因子等，将来可以进一步完善；将该复合物应用于临床试验也待于后续研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

膀胱脱细胞胶原基质复合血管内皮生长因子修复兔尿道缺损

Bladder acellular matrix combined with vascular endothelial growth factor repairs rabbit urethral defects

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